下尿路专栏 | 压力性尿失禁干细胞相关治疗研究及应用系列之二

接上期系列一，本期主要介绍干细胞及其分泌物在压力性尿失禁的临床前研究中的应用情况。目前临床前研究使用到的实验动物主要是大鼠，通常用以下3种造模方式来模拟大鼠SUI：

1.括约肌损伤；

2.神经损伤；

3.阴道扩张（Vaginal distention, VD）

其中括约肌损伤可通过电凝、灼烧或注射肌肉毒素来诱导；神经损伤通常通过阴部神经横断（Pudendal nerve transection, PNT）或阴部神经钳夹损伤(Pudendal nerve crush, PNC)来诱导，在较早的研究针对其更上游分支的，包含坐骨神经横断或钳夹损伤也较常见；而VD是最常见的研究与分娩损伤及损伤后恢复的动物模型。有时候，研究者会通过联合使用以上损伤造模方式来增强SUI控尿功能损伤造模的效果及持续时间。

下面介绍各类干细胞具体的临床前研究及应用：

诱导多能干细胞是指通过转染等途径将与细胞多能性相关的基因（如Oct4，Sox2等）导入已分化的体细胞中，使体细胞重编程回胚胎干细胞的状态，所获得的细胞即为iPSCs。斯坦福大学Bertha Chen团队在iPSCs治疗SUI方面做了大量研究。他们将iPSCs分化成平滑肌肌祖细胞（pSMC）并注射至双侧卵巢切除+尿道松解手术的大鼠尿道周围。5周后与手术+生理盐水组大鼠比较，手术+pSMC组大鼠的漏尿点压及括约肌肌电活动显著改善。鉴于一些研究发现，成体干细胞无法产生充足的平滑肌细胞来维持尿道功能，对于iPSCs的深入研究可能有利于解决这一问题。

MDSCs在SUI的细胞治疗中应用最为广泛。它们来源于丰富的肌肉组织，可以在局麻下获得，过去也曾被称作肌卫星细胞(satellite cells)、肌前体细胞(muscle precursor cells, MPCs)等。值得注意的是，在不同的研究中，即便是相同课题组在不同时间点所做的研究，他们所使用的“MDSCs”可能大不相同。这是由于MDSCs在体外分离及扩增时容易分化，而目前又缺少标准的分离、扩增及鉴定MDSCs的流程。因此，早期在SUI治疗中使用的肌源性细胞（muscle-derived cells, MDCs）中不仅仅包含MDSCs，也有相当数量的成肌细胞等其他细胞在内的成分。

2002年，R. Yiou首次报道了单独的MDSCs在SUI治疗中的作用。他发现尿道损伤的大鼠在局部注射MDSCs 7天及1月后，肌纤维的直径增粗，数量增多，但他仅检测了组织学的变化。紧接着Lee等人研究了MDSCs对坐骨神经横断大鼠尿道功能学的影响。大鼠经尿道旁注射MDSCs 1周及4周后，LPP均显著提高。在此后的几年间，关于MDSCs治疗SUI的研究层出不穷。Chermansky等人发现中段尿道损伤的大鼠在注射了MDSCs后漏尿点压显著增强，且MDSCs已成功进入横纹肌层。在另一项研究中，MDSCs在注射4周后一些肌肉特异性分子呈阳性表达，说明MDSCs已分化为肌系细胞，这可能对损伤后的肌肉组织修复起作用。总体上来说，MDSCs治疗SUI与其肌系分化能力密切相关。

一些研究表明，MDCs或MDSCs较成纤维细胞及其他类型的MSCs在治疗SUI上有明显优势。Kwon在单侧坐骨神经横断的大鼠中分别注射了MDCs或成纤维细胞。4周后虽然两组大鼠的漏尿点压无显著差异，但MDCs组大鼠尿道肌肉收缩幅度更大。这可能是由于成纤维细胞通过加固尿道支撑组织中的细胞外基质来加强尿道闭合力量，而MDCs通过分化为括约肌细胞加强尿道闭合力量。崔林刚等人发现MDSCs注射较ADSCs注射对内在括约肌缺陷（ISD）大鼠的储尿功能有明显改善。组织学结果显示MDSCs注射后尿道有着更高的α-SMA和肌球蛋白表达。由于MDSCs主要向肌源性分化为成肌细胞或肌细胞，而括约肌对控尿功能影响较大，因此，MDSCs相较于其他MSCs在SUI治疗，特别是外括约肌损伤模型的治疗中效果更为显著。

自从2010年Lin等人首次将ADSCs应用于SUI治疗，大量的研究证实了ADSCs的作用。吴桂珠等人发现ADSCs显著改善了阴部神经切除大鼠尿道括约肌的形态及功能。傅强等人在体外将ADSCs分化为成肌细胞并注射进VD大鼠尿道，3个月后该组大鼠较未分化ADSCs注射组大鼠相比，漏尿点压显著提高。以上2项研究说明ADSCs的肌源性分化起了重要作用。

后续研究发现，ADSCs除了通过促进括约肌层再生外，还可能通过血管、弹性纤维、神经等尿道及周围结构的修复再生治疗SUI。Lin等人发现VD+卵巢切除大鼠在尿道或尾静脉注射ADSCs后，排尿功能均显著改善，尿道组织弹性纤维及平滑肌含量均显著增多。Li等人深入研究发现ADSCs尿道旁注射显著增加了VD大鼠尿道的弹性纤维，网状纤维及1型胶原/3型胶原比值，以及血管密度。此外，细胞外信号调节激酶（p-ERK，一种调控细胞增殖的激酶）在ADSCs组的大鼠尿道表达上升，这可能是引起上述变化的原因。

近年来，ADSCs分泌物（包括可溶性因子、外泌体及微小囊泡）治疗SUI的研究日益多见。Li等人发现培养过ADSCs的微组织（MTs）尿道注射同样能引起阴道扩张大鼠排尿功能的改善以及破碎的外括约肌、平滑肌的修复。与ADSCs细胞注射相比，MTs组大鼠尿道中血管内皮生长因子（VEGF）及神经生长因子（NGF）等生物活性因子表达显著上升，这可能是由于MTs富含这些活性因子。刘小春等人在体外研究中发现ADSCs分泌的外泌体显著提高了SUI患者阴道壁成纤维细胞1型胶原及金属蛋白酶组织抑制物1和3的表达，而抑制了基质金属蛋白酶1和2的表达。倪建数等人也提取了ADSCs外泌体并将其注射于VD + PNC大鼠尿道，显著改善了尿道功能，横纹肌纤维和周围神经纤维数量。以上几项研究表明，ADSCs可通过旁分泌作用治疗SUI，而不通过直接分化作用。

骨髓间充质干细胞在骨髓基质部分发育，能够自我更新和分化为多种细胞类型。骨髓间充质干细胞在足够的密度下相对容易获得。此外它们自然状态下易贴壁，这使得它们培养时容易生长和扩增。BMSCs还具有很强的趋化特性，与假VD组大鼠相比，VD组大鼠在腹腔注射BMSCs 4天后尿道、阴道、直肠、提肛肌等损伤部位BMSCs显著增多。BMSCs的趋化特性使得其有充足的数量来发挥治疗SUI的作用。

Yoshiaki Kinebuchi在2010年进行了首次BMSCs治疗SUI的研究，他发现尿道松解术后大鼠经BMSCs注射13周后，漏尿点压显著提高,注射至尿道旁的BMSCs分化为了横纹肌细胞和周围神经细胞。Jacques Corcos等人发现PNT大鼠尿道外括约肌发生萎缩，而注射BMSCs后尿道外括约肌出现再生及肌球蛋白重链、结蛋白等肌性分子标志物阳性。同样地，Sun-Ouck Kim等人也发现BMSCs在注射4周后提高了双侧阴部神经离断大鼠的漏尿点压及闭合压，BMSCs呈平滑肌肌动蛋白、结蛋白等肌肉特异性分子阳性。以上这些研究说明BMSCs主要通过分化为尿道平滑肌细胞及外括约肌细胞来改善SUI。

一项RNA-seq研究筛选出了一些BMSCs调控大鼠尿道及邻近阴道改变的候选基因。VD + BMSC处理组与单纯VD处理组的差异表达基因主要参与了细胞外基质的稳定与再生，细胞因子信号转导修饰，细胞周期调控，肌肉分化等。这些差异基因可能一定程度上促进了BMSC注射后大鼠尿道功能学及组织学上的改变。

Huc-MSCs在SUI治疗的研究较少。在功能学研究中，孙晓莹等人将Huc-MSCs注射至VD +双侧卵巢切除大鼠的耻尾肌或膀胱颈。4周后耻尾肌注射Huc-MSCs提高了造模后大鼠的漏尿点压，但未改变膀胱最大容量；膀胱颈注射Huc-MSCs则同时提高了以上两个指标。他们在另一项研究中将Huc-MSCs注射至尿道周围或坐骨神经近端进行对比。1个月后Huc-MSCs注射至尿道周围提高了SUI大鼠的漏尿点压，但未改变膀胱最大容量；而注射至坐骨神经近端对这两个指标均无影响。在功能学及组织学联合研究中，Kyung-Jin Lee发现人脐带血单个核细胞（不完全是Huc-MSCs）能使ISD模型大鼠LPP改善，受损的外括约肌恢复，而尿道胶原沉积减少。蓝建发等人发现，尿道周围注射Huc-MSCs提高了SUI模型大鼠的漏尿点压及膀胱最大容量，增强了尿道括约肌中肌细胞标志物结蛋白、肌球蛋白重链及神经轴突标志物PGP9.5的表达。

尿源性干细胞（Urine stem cells, USCs）可以直接从人尿液中提取，并在体外扩增，因为它们不需要酶消化来收集细胞。任何年龄的患者都可以从尿液样本中反复获得USCs，且患者耐受性良好。目前仅有1例USCs外泌体治疗大鼠SUI的报道。VD大鼠经耻尾肌局部注射USCs外泌体后，漏尿点压及断裂的耻尾肌显著恢复。体外实验发现，USCs外泌体能显著增强成肌细胞的增殖能力和分化能力，且ERK通路的激活在其中发挥着重要作用。

人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells, hDPSCs)可通过非侵入的方式获得，可发挥免疫调节的作用并分化为多种细胞。Alessio Zordani等人发现hDPSCs在体外能向肌系细胞分化；当注射至PNT大鼠的尿道外括约肌4周后，大鼠漏尿点压提高，外括约肌层增厚，损伤的阴部神经部分再生。

目前，吊带手术等外科治疗仍然是临床上非手术治疗SUI无效时的首选治疗方式，但它仅作为对症治疗的方式，并会引起包括疼痛，感染，尿潴留，膀胱尿道损伤或侵蚀在内的相关并发症。邹小辉等人将BMSCs包被在吊带上，双侧坐骨神经近端横断大鼠经BMSCs包被吊带治疗后，尽管在第4周时漏尿点压较单纯吊带治疗组大鼠无差别，但在第12周时有着更高的胶原含量及括约肌收缩力。

【未完待续 | 整理编辑自温州医科大学第一临床泌尿外科学研究生论文。蒋明辉，主要课题干细胞治疗尿失禁，发表相关SCI论文1篇（中科院1区）和相关国际学会（AUA、ICS）年会摘要3篇】

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