ASCO2021 | 血浆外泌体 micro RNA-155：肾癌免疫治疗的潜在生物标志物

【2021年ASCO 摘要 4570 】免疫检查点抑制剂治疗转移性肾癌患者血浆外泌体microRNA-155的表达：对全身治疗反应的潜在生物标志物

背景：

寻找一个可靠的预测免疫检查点治疗（ICBT）反应的生物标志物仍然是管理转移性肾细胞癌（mRCC）的迫切需要。我们试图评估血浆外泌体microRNA（miRNAs）在肾细胞癌和肿瘤微环境（TME）扩增中的生物标志物潜力。

方法：

在40例mRCC患者（ICBT前）和30名健康志愿者中评估了11个在RCC和/或免疫相关基因中过度表达的miRNA。从500uL血浆中提取外泌体，用于提取miRNA。RT-PCR检测MiRNAs的表达。将周期阈值标准化为miR-30-3b，并将其相对表达量（RQ）与健康志愿者进行比较，并使用2ΔΔCt法计算。采用Mann-Whitney U检验，根据应答者(n=27)与无应答者(n=13)对一线ICBT的最佳应答，评价mRCC患者与健康志愿者之间miRNAs的表达。用Youden指数确定显著表达的临界值。应答者定义为完全应答、部分应答或病情稳定的患者，无应答者定义为病情进展的患者。

结果：

最常见的一线免疫检查点抑制剂治疗是nivolumab+ipilimumab（n=32），其次是pembrolizumab+axitinib（n=5）和avelumab+axitinib（n=3）。与健康志愿者相比，患者中miRNA-1233（中位数为1.85 vs. 0.81 p=0.008）和miRNA-155[miR-155]（3.69 vs. 0.21 p=0.006）的表达显著增高。MiR-155的高表达与较高的Fuhrman分级相关（p=0.002）。与其他临床预后因素无关。MiR-155在有应答者中的表达水平明显低于无应答者（中位数为0.61 vs. 35.29，p=0.042）。MiR-155（RQ≤ 2.5）低表达和高表达患者的应答率有统计学差异（p=0.042），84.2%的低miR-155表达的患者对治疗有反应。

结论：

mRCC患者miR-155低表达与ICBT应答相关。在功能上，miR-155参与TME的调控。这些结果强调了在这一领域需要进一步的工作来阐明这个和其他miRNAs作为mRCC反应的生物标志物的作用。

述评

肾癌，又称肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC），发病率约占实体瘤的3%，每年估计新发病例数约33万^[1]。大约三分之一的患者在首诊时即为晚期RCC，另外30%的患者在根治性肾切除术后发生转移。转移性肾细胞癌（mRCC）的预后通常很差，预测的5年生存率低于20%^[2]。

在近几十年里，由于对肾癌分子生物学研究的深入，直接导致了一些有效的新药进入临床，并取得惊人的疗效。首先是以血管内皮生长因子（VEGF）及其受体为靶点的抗血管生成靶向药物（图1）；其次是免疫检查点抑制剂（ICIs）药物的应用。它们彻底改变了mRCC的治疗手段和预后。这些新治疗药物的单独或联合应用，可以显著改善患者的生存时间和生活质量^[3-6]。

图1  常用靶向药物及其作用机制

然而，通过ICIs治疗获得显著而持久疗效的mRCC患者比例有限。寻找一个可靠的预测ICIs治疗反应的生物标志物仍然是管理转移性肾细胞癌（mRCC）的迫切需要。这些生物标志物可以识别哪些患者注定从ICIs治疗中获益，哪些患者不能获益。当前，我们最熟悉的涉及ICIs治疗的生物标记物是PD-L1表达和肿瘤突变负荷（TMB）（图2）。但是，这两个生物标记物的临床应用存在极大的局限性和争议性。

图2  免疫治疗的潜在生物标志物，以及免疫检查点抑制剂的作用机制。

肿瘤细胞PD-L1表达是第一个，也是研究最多的针对ICIs药物应答的潜在生物标记物。时至今日，PD-L1免疫组化表达对ICIs治疗反应的潜在预测价值有争议，甚至与我们的预测结果背道而驰。在CheckMate 025临床研究中进行的探索性分析发现PD-L1表达≥ 1%的患者，与PD-L1表达<1%的患者相比，观察到较低的OS，以5%为截止值的趋势相似^[7]。

肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）是一种免疫治疗反应增强的生物标志物。TMB的定义是肿瘤基因组每个编码区的突变总数，以每兆碱基的突变（突变/Mb）来计算。肿瘤细胞中发生的基因组改变代表了产生肿瘤特异性抗原（新抗原）的能力，这些抗原可能被处理并表达在癌细胞表面，因此被T细胞识别，从而引发抗肿瘤反应^[8]。TMB与ICIs敏感性的潜在关联是基于一种假设：在TMB高的肿瘤中，新抗原的产生增加，从而刺激抗肿瘤免疫系统的反应^[9]。但这种假设却忽略了一个问题，TMB的“质”，即新抗原的免疫原性。也就是说，新抗原的免疫原性低，即使“量（负荷）”再多，可能也无法激活免疫系统。做个比喻，一支点着的蜡烛可以照亮一整间卧室，但一百只发光的萤火虫却不能。但就RCC而言，关于TMB的预后价值及其与mRCC免疫治疗应答的潜在相关性的结果是相互矛盾的。RCC对免疫治疗的应答率很高，但它的TMB平均较低，只有1.1个突变/Mb，而黑色素瘤和NSCLC的TMB值在10到400个突变/Mb之间^[10,11]。正是基于这样的背景，需要研究者寻找新的肿瘤生物标志物指导治疗。

今年ASCO会议中，来自加拿大的研究小组探讨了血浆外泌体micro-RNA-155作为生物标记物预测RCC患者ICIs治疗应答。结果发现MiR-155（RQ≤ 2.5）低表达和高表达患者对ICIs治疗应答率有统计学差异（p=0.042），84.2%的低miR-155表达的患者对治疗有反应。结果提示，miR-155是潜在的ICIs治疗生物标记物。

2013年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼以及德国科学家托马斯·祖德霍夫，以表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制。外泌体（exosomes）作为细胞外泌的一类重要囊泡，也开始受到重视。外泌体参与机体的免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应等重要的调控过程。细胞会通过分泌内包含多种不同分子的外泌体，将一些信号分子分泌到较远的组织或细胞中，以起到调控作用。而外泌体内包含分子包括蛋白质、脂质、DNA、mRNA和miRNA，其中miRNA受到最多的关注。

miRNA，或micro-RNA，是一类小的非编码RNA，通过与mRNA的3’UTR或者开放阅读框ORF区域结合，能介导基因的转录后沉默。miRNA与细胞增殖分化、迁移、疾病发生和疾病进展都有关系。它们可以稳定存在于血液、唾液和尿液中，通过循环囊泡传递信息，被认为是除细胞接触依赖的信号传导和可溶性分子介导的传导外，细胞间信号交流的第三种途径。在肿瘤中异常表达的特异性miRNAs被定义为癌性miRNAs（oncogenic micro-RNAs），其可过度表达或表达不足，但最常见的是表达下调。研究发现，参与RCC进展的许多分子，如HIF、VEGF或mTOR，可能的靶点是失调节的miRNAs。因此，miRNA标志物可作为肾癌的生物标志物用于诊断、复发和转移风险分类以及指导治疗。

在肾细胞癌组织和正常肾组织中miRNAs表达水平的比较性研究中发现了一系列下调和上调miRNAs（图3）。上调的miRNAs包括miR-210、-155、-21，-142-3p、-185、-34和-224，它们通过下调肿瘤抑制基因发挥作用。miR-210和-155是已知的与HIF分子和缺氧有关。另一方面，下调的miRNAs包括miR-149、-200c和-141，其丢失导致癌基因的激活^[12,13]。特别地，miR-141和-200c是miR-200的成员，它们在不同的肿瘤中常被关闭，与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关（上皮细胞-间质转化（EMT），是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用，其主要的特征有细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白)表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等）^[14]。

图3.  在RCC中失调节的miRNAs

由于许多参与RCC进展的分子，如HIF、VHL、VEGF或mTOR，是失调节miRNAs的可能靶点^[15]。许多研究都集中探索RCC上调或下调的miRNAd的生物学意义上。如miR-21是一种致瘤性miRNA，参与肿瘤的进展和转移。一项由针对ccRCC基因组研究表明，miR-21与差的生存状况和向“Warburg effect”状态转变有联系（图4）^[16]。miR-99a在几种恶性肿瘤中表达下调。肾肿瘤组织中miR-99a水平明显低于邻近正常组织。并且miR-99a的低表达水平与肾细胞癌的低生存率有关^[17]。

既往的研究告诉我们，外泌体所包含的miRNA可能会成为诊断和治疗某些疾病的特殊标志物，或疾病的预后因子。而本研究的意义在于，扩大了外泌体miRNA在临床应用的范围，其可以作为预测ICIs治疗反应的生物标记物，是对现有外泌体miRNA研究的重要推动。

图4  正常分化的细胞主要依靠线粒体的氧化磷酸化为细胞供能，而大多数肿瘤细胞则依赖有氧糖酵解，这种现象被称为“Warburg effect”

致谢：

本文部分内容翻译自文献《Renal cancer biomarkers: the promise of personalized care》和《Oncogenic micro-RNAs and renal cell carcinoma》。

Authors:

Maryam Soleimani, Marisa Thi, Neetu Saxena, Bernhard J. Eigl, Daniel Joseph Khalaf, Kim N. Chi, Christian K. Kollmannsberger, Lucia Nappi; 

Academic Institutions:

BC Cancer, Vancouver, BC, Canada; Vancouver Prostate Centre, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada; 

Vancouver Prostate Centre, Vancouver, BC, Canada; 

Department of Medical Oncology, BC Cancer-Vancouver Centre, Vancouver, BC, Canada; 

BC Cancer-Vancouver Centre, Vancouver, BC, Canada; 

Division of Medical Oncology, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada.

Research Funding:

GUMOC Bayer Research Grant Program jointly established by the Genitourinary Medical Oncologists of Canada (GUMOC) and Bayer Canada.

Background:

The search for a reliable predictive biomarker of response to immune checkpoint-based therapy (ICBT) remains a critically unmet need in the management of metastatic renal cell carcinoma (mRCC). We sought to evaluate the biomarker potential of plasma exosome microRNAs (miRNAs) implicated in RCC and in augmentation of the tumour microenvironment (TME) for such a role.

Methods:

Eleven miRNAs that are over-expressed in RCC and/or immune-associated were evaluated in 40 patients with mRCC (prior to initiating ICBT) and in 30 healthy volunteers. Exosomes were extracted from 500 uL of plasma and were used for miRNAs extraction. MiRNAs expression was evaluated by RT-PCR. Cycle threshold values were normalized to miR-30-3b, and the relative quantity of the expression (RQ) was compared to those of healthy volunteers and calculated using the 2ΔΔCt method. Mann-Whitney U test was used to evaluate the expression of miRNAs between mRCC pts and healthy volunteers according to best response to first line ICBT between responders (n = 27) v non-responders (n = 13). The cut-off value of significant expression was established by Youden’s index. Responders were defined as those patients experiencing complete response, partial response or stable disease and non-responders were those who experienced progressive disease.

Results:

The most common first line ICBT was nivolumab + ipilimumab (n = 32), followed by pembrolizumab + axitinib (n = 5), and avelumab + axitinib (n = 3). A significantly higher expression of miRNA-1233 (median 1.85 v 0.81 p = 0.008) and miRNA-155 [miR-155] (3.69 v 0.21 p = 0.006) were found in patients compared to healthy volunteers. Higher miR-155 expression was associated with higher Fuhrman grade (p = 0.002). There was no association with other clinical prognostic factors. MiR-155 was expressed at a significantly lower level in responders than in non-responders (median 0.61 v 35.29, p = 0.042). Response rate amongst patients with low and high expression of miR-155 (RQ ≤ 2.5) was statistically different (p = 0.042) and 84.2% of the pts with low miR-155 expression responded to the treatment.

Conclusions:

Lower expression of miR-155 was associated with response to ICBT in patients with mRCC. Functionally, miR-155 is involved in regulation and modulation of the TME. These results underscore the need for further work in this area to elucidate the role of this and other miRNAs as biomarkers of response in mRCC.

         

     

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【参考文献】

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作者简介

王欢，岳阳市一人民医院主任医师，医学博士，美国梅奥医学中心临床访问医生。

中国抗癌协会肿瘤标志物专业委员会会员；学习联盟通讯员；国际尿石症联盟青年委员；湖南省前列腺疾病专业委员会学术委员；中国性学会基层泌尿男科分会委员；湖南省中医药和中西医结合学会性与泌尿生殖医学专业委员会委员；中国性学会妇幼保健男科分会委员；岳阳市内镜质量控制委员会委员；岳阳市泌尿外科专业委员会委员；岳阳市加速康复专业委员会学术委员。主持省级科研课题1项，参与省市级课题研究3项。以主要负责人获得湖南省科技进步奖三等奖一次，岳阳市科学技术进步一等奖一次；近年来以第一作者和通讯作者发表论文30余篇，SCI收录论文3篇； 实用新型专利1项。