文献学习 | 线粒体-内质网接触位点通过RMDN3/PTIP51磷酸化介导脂质自由基转移，以减少线粒体氧化应激

线粒体与内质网之间存在物理联系（线粒体-内质网接触，MERC）。MERC可能支持各种细胞反应：钙信号传导、脂质代谢、线粒体质量控制、自噬、细胞凋亡、内质网应激。已知的MERC系留因子包括：MFN2、PDZD8、RMDN3/VAPB。

线粒体能量代谢过程中约2%的氧分子被还原为ROS（H2O2、羟基自由基），而线粒体应对ROS的措施包括：SOD（超氧化物歧化酶）催化、GSH-Px酶降解、GSH干预。

56名患者，80个样本。样本分为discovery组（48名患者的48个样本）和验证组（8名患者的32个样本）。

BPH组，前列腺癌组（TRNA），新辅助治疗后组（NEADT），CRPC组。

1、NanoLuc Binary Technology通常由LgBiT和SmBiT两种亚基构成，二者可以可逆性结合，结合后发光性极强。

2、线粒体标记：TOMM20（外膜蛋白）偶联SmBiT。

3、内质网标记：Sec61β（ER定位蛋白）偶联LgBiT。

4、构建完成后检测标志物是否影响线粒体-内质网接触，结果提示不影响。

5、两种亚基在细胞中均稳定表达，且只有二者结合后荧光信号强度才会发生明显提升。

6、敲低/敲高已知的几种系留蛋白影响线粒体-内质网接触后，荧光信号强度改变，证明模型构建成功。

二、探索引起MERC增多的原因，是ROS还是氧化磷酸化水平

使用鱼藤酮、抗霉素促进线粒体ROS产生增多后，线粒体-内质网接触水平提升。

同时，荧光信号也增强，且这种增强可以被线粒体特异性ROS清除剂——Mito TEMPO逆转，说明线粒体ROS是促进MERC增多的原因。

首先分别使用氧化应激诱导剂（tBHP）和鱼藤酮、抗霉素A分别处理模型细胞。

对对照组、加药组分别给予oxNAC、NACS2，发现药物引起的MERC荧光增强现象会被逆转。

2、尝试敲低影响线粒体内GSH和GSH过硫化物水平的关键基因后发现只有添加GSH过硫化物原料才能逆转荧光信号强度的提升。

综上，GSH过硫化物是影响ROS-MERC形成的关键。

1、通过给予不同的DAAO促进不同位置ROS产生，明确只有线粒体内ROS会引起MERC荧光信号强度升高。

2、使用流式分选技术，将细胞按照mitoROS水平的高低进行区分，比较区分后的两组细胞，发现mitoROS高组细胞的MERC荧光信号强度也更高，且NAC对荧光信号强度的影响依然存在。

1、和所有的医学工作者一样，研究者面对多种可能性时使用穷举法，把已知的MERC相关系留因子分别都敲低，寻找ROS引起MERC增多的关键，最终发现时RMDN3-VAPB明显相关。

2、免疫共沉淀也证明加入鱼藤酮、抗霉素A后二者的共沉淀增多。

3、观察细致的读者或许也和研究者一样发现了一个问题，为什么敲低RMDN3或VAPB后，荧光信号降低幅度不一样？

4、查询既往文献后，研究者了解到二者的结合是通过RMDN3的FFAT样基序与VAPB的MSP区域结合实现的，而VAPA同样也包含MSP这一区域。此外VAPA/VAPB还包含一个TPR区域，该区域与脂质转移相关，也能和FFAT样基序结合。

5、同时敲低VAPA、VAPB后，MERC荧光强度的降低水平基本与敲低RMDN3一致。

6、研究者进一步探究了TPR区域是否也参与了RMDN3-VAPA/B的结合，结果发现无明显作用。

1、通过查询文献，研究者获知磷酸化是调控RMDN3的FFAT样基序和MSP区域结合的关键，磷酸化的位点为T160。基于此研究者推断ROS可能促进了FFAT样基序的磷酸化。

通过使用磷酸化检测凝胶，研究者明确了ROS对RMDN3 FFAT样基序的影响。

2、通过培养T160缺陷的模型细胞，研究者验证了RMDN3的T160位点的磷酸化是ROS通过调控其与VAPB结合进而促进MERC增多的原因。

1、研究者使用了cck8检测长期给予鱼藤酮、抗霉素处理，或敲低CARS2、SLC25A39的细胞在敲除系留因子后的活性，发现敲除RMDN3-VAPB后细胞活性大幅降低。

2、添加GSH过硫化物合成原料可以逆转RMDN3敲除对细胞活性的影响，说明ROS引起的RMDN3-VAPB结合对抑制细胞死亡有关键作用。

3、当FFAT或TPR区域缺陷时，细胞活性均受到影响，说明TPR虽然不影响RMDN3-VAPB结合，但对保护细胞活性有作用。

4、研究者使用常见的细胞死亡途径抑制剂，寻找能产生逆转现象的干预，结果提示DFO铁螯合剂能够逆转。

这一现象说RMDN3-VAPB的保护作用针对的主要是铁离子催化形成的羟基自由基。

1、整理思路后，研究者猜测RMDN3-VAPB中的TPR区域的脂质转移功能可能起到了保护作用。

2、敲除VAPB和RMDN3都会引起线粒体特异性的脂质过氧化荧光强度增强。

3、在敲除CARS2、SLC25A39或使用抗霉素A、鱼藤酮处理的情况下，研究者验证了TPR区域的缺陷将无法降低线粒体特异的脂质过氧化荧光强度，证明了其的作用。考虑到TPR区域具备脂质转移功能，这是否是其发挥保护作用的原因？

1、研究者使用了脂质体转移实验进行验证。

简单理解为检测不同颜色的荧光，明确脂质自由基的转运情况。

2、检测红色荧光，提示随着RMDN3 TPR浓度增加，脂质体转运水平逐步增加。

3、检测绿色荧光，结果提示随着RMDN3 TPR浓度增加，脂质自由基转运大幅增多。

4、在受体存在的情况下，RMDN3存在与否明显影响了脂质自由基荧光强度（原图片疑似标注错误，检查原文这里作者意为受体是控制变量，主要研究的是RMDN3的影响，提供的图片则是显示了受体存在与否对荧光的影响）。

该研究首先基于NanoLuc Binary Technology技术构建了一个可以代表线粒体-内质网接触（MERC）的细胞模型，随后研究者如剥洋葱般逐步探究了什么引起MERC增多——线粒体ROS，什么系留因子起关键作用——RMDN3-VAPB，ROS怎么调控系留因子——RMDN3的FFAT样基序的T160位点的磷酸化，MERC对细胞活性的影响——保护作用，如何发挥保护作用——RMDN3-VAPB的TPR区域的脂质转移功能将脂质自由基转移出线粒体，从而保护了线粒体功能和细胞活性。从表型到机制到具体的修饰调控途径研究思路清晰，适合科研工作者学习借鉴。